本发明涉及生物技术领域内的蛋白质分析、制备和诊断技术,涉及高效活性表达的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域蛋白的用途,鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域碱基序列见序列表中序列1所示,在筛选DTMUV抗原表位核心区域的基础上,建立了高敏感性、准确性和操控性强的间接ELISA检测方法,为有效预防和控制DTMUV的传播提供强有力的工具和技术支撑。
1.一种高效活性表达的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域表达蛋白在鸭坦布苏病毒的ELISA检测方法中的应用,鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域碱基序列如序列表中序列1所示;鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域表达蛋白是通过以下步骤得到的:设计鸭坦布苏病毒E蛋白DIII的PCR扩增表达引物:EDIIIexp-1:5’-CATGCCATGGAAAGGCATGACCTACCCGATGTG-3’,EDIIIexp-2:5’-CCGCTCGAGACTTCTATGCCACTGGTACCT-3’,用于鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原基因的克隆,采用NcoI和XhoI双酶切PCR产物后,连入同样双酶切的质粒中,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌表达菌株进行活性表达;所述鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域表达蛋白作为ELISA包被蛋白,用于鸭坦布苏病毒的ELISA检测。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于大肠杆菌表达菌株在18°C,IPTG浓度为0.2mM过夜诱导培养。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于对大肠杆菌菌体进行超声破碎,收集上清蛋白,选用镍柱进行纯化得到鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域的高纯度表达蛋白。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于首先用pH值为8.0、含50mMTris和300mMNaCl的缓冲液平衡柱体,然后使上清蛋白经过柱体,最后用咪唑进行梯度洗脱,洗脱液为50mMTris,300mMNaCl和浓度分别为0mM、20mM、40mM、50mM、250mM的咪唑,pH值为8.0,收集洗脱的蛋白在pH7.4、20mMTris的条件下透析,获得纯度为90%的高纯度蛋白。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于ELISA包被蛋白的包被浓度为0.5ug/mL。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于所用的ELISA板为用100uL含0.5ug/mL鸭坦布苏病毒EDIII蛋白的包被液室温作用30min后4°C包被过夜,PBST洗板3次,加入封闭液,37°C封闭2h的酶标板。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于所用包被液为含15mMNa₂CO₃,35mMNaHCO₃,pH9.6的溶液;所用PBST为每1000mL溶液含8gNaCl,0.2gKCl,2.9gNa₂HPO4.12H₂O,0.2gKH₂PO₄,0.5mLtween-20;所用底物缓冲液为每500mL溶液含14.2g柠檬酸,10.5gNa₂HPO₄
.12H₂O;所用底物溶液为0.1g/100mL无水乙醇10mL,底物溶液90mL,H₂O₂750uL临用前配制而成;所用封闭液为含1%BSA的PBST;所用酶标二抗是以PBST1:5000稀释。技术领域
本发明涉及生物技术领域内的蛋白质分析、制备和诊断技术,涉及高效活性表达的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域蛋白的用途。
背景技术
2010年,一种新型的鸭源黄病毒在我国规模化养鸭场爆发并迅速蔓延至全国,给我国养鸭业带来了巨大的经济损失。该病原-鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus,DTMUV)为黄病毒科、黄病毒属成员,为有囊膜不分节段单股正链RNA病毒。鸭感染DTMUV后主要出现神经症状、采食量减少、产蛋严重下降甚至绝产,并出现大量死亡。感染DTMUV的鸭容易继发病毒性肝炎、传染性浆膜炎、大肠杆菌等其他疾病,疾病发生后由于大量应用药物,导致药物残留严重,影响到鸭肉品质和人类健康。此外,水禽是流感病毒在自然界中的重要“贮存器”,一旦自身免疫力下降,就会造成流感病毒的大量增殖和重组变异。鉴于DTMUV产生和潜在的巨大危害,必须建立合理的防控和监测措施,全面及时的了解鸭群的感染带毒状况。因此,标准化、高准确度的血清学检测方法成为必然。国际上通用的黄病毒属血清学检测方法有ELISA、AGP、血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CF)和中和实验(NT)等,但ELISA具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、操作简便等优点。CN103869066A公开了一种坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法。检测灵敏度及准确性,是判断检测方法好坏的依据。现有技术中公开的ELISA检测方法,灵敏度及准确性,都有很大的提升空间。
发明内容
为了解决以上现有技术中坦布苏病毒的ELISA检测方法中存在的灵敏度及准确性不高的问题,本发明提供了一种高效活性表达的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域蛋白在坦布苏病毒的ELISA检测方法中的应用。本发明是通过以下措施实现的:本发明所述的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域的确定,是根据鸭坦布苏病毒E蛋白的表达产物进行同源建模,通过分析其完整3D结构、蛋白组成及各组成区域精细结构,发现E蛋白在病毒表面折叠成3个不同结构域I-III(DomainI-III):DI是由8个β折叠片组成的桶状结构,位于蛋白的中心位置,为图中浅灰区域;DII(图中深灰色区域)则是形成延伸的指状结构,其序列穿插于DI序列之中,在DII末端即为融合环;在DII相反的方向为DIII(图中黑色区域),为Ig样(Immunoglobulin-like)结构域,是典型的免疫球蛋白结构,含有7个β片层,同时根据其他相似黄病毒的研究和对该区域精细结构分析发现,此区域是病毒抗原表位存在的主要位置;此外,通过对黄病毒进入宿主细胞的过程研究,发现DTMUVE蛋白中His144、His285、His320位于DI和DIII之间的界面上(见图1标注),参与E蛋白pH依赖的构象改变,也是抗体作用的主要位点。所以,由以上蛋白质结构可知,DTMUV抗原优势区域位于E蛋白的DIII。本发明所述的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域(碱基序列见序列表中序列1所示,以下简称EDIII)的表达,是在确定核心抗原域的基础上,首先设计鸭坦布苏病毒E蛋白DIII的PCR扩增表达引物EDIIIexp-1:5’-CATGCCATGGAAAGGCATGACCTACCCGATGTG-3’(包含NcoI酶切位点),EDIIIexp-2:5’-CCGCTCGAGACTTCTATGCCACTGGTACCT-3’(包含XhoI酶切位点),用于鸭坦布苏病毒EDIII的克隆。采用NcoI和XhoI双酶切PCR产物后,连入同样双酶切的pET32a中,构建重组表达质粒pET32a/EDIII,然后转化大肠杆菌表达菌株RosettagamiB(DE3)进行EDIII的高效活性表达。SDS-PAGE结果显示,当温度为18°C,IPTG浓度为0.2mM过夜诱导培养时,实现了EDIII蛋白的高效可溶性表达,蛋白表达量可占到菌体总蛋白的42%,并且蛋白具有天然活性。本发明所述的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域的表达还包括表达蛋白的高纯度制备。菌体进行超声破碎,收集上清蛋白,选用镍柱进行纯化。首先用含50mMTris和300mMNaCl(pH值8.0)的缓冲液平衡柱体,然后以合适的速度使上清蛋白经过柱体,最后用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱,洗脱液为50mMTris,300mMNaCl和0mM、20mM、40mM、50mM、250mM不同浓度的Imidazole(pH值8.0),收集洗脱的蛋白在20mMTris(pH7.4)的条件下透析。最终获得纯度为90%的高纯度蛋白。本发明所述的鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA诊断方法其特征在于:用原核表达的高纯度活性EDIII蛋白作为ELISA包被蛋白,每孔加入100uL含0.5ug/ml的EDIII蛋白的包被液,室温作用30min后4°C过夜,PBST洗三次,37°C封闭2h,然后加入待检的稀释10000倍的鸭坦布苏病毒血清,每孔100uL,室温作用0.5h,PBST洗板3次后加入100uL1:5000稀释的兔抗鸭酶标二抗,室温0.5h,PBST洗板3次,最后加入100uL1mg/mLTMB底物,室温作用15min后加入终止液,酶标仪中测定OD450值。反应同时设阳性和阴性对照,阴性阳性的判定标准为当OD450检测值-阴性对照均值/阳性对照均值-阴性对照均值,所得比值大于等于0.2为阳性,小于等于0.2为阴性。本发明提供的ELISA检测试剂盒,其特征在于:所用的ELISA板为用100uL含0.5ug/mL鸭坦布苏病毒EDIII蛋白的包被液室温作用30min后4°C包被过夜,PBST洗板3次,加入封闭液,37°C封闭2h的酶标板。所用包被液为含15mMNa₂CO₃,35mMNaHCO₃,pH9.6的溶液。所用PBST为每1000mL溶液含8gNaCl,0.2gKCl,2.9gNa₂HPO4·12H₂O,0.2gKH₂PO₄,0.5mLtween-20。所用底物缓冲液为每500mL溶液含14.2g柠檬酸,10.5gNa₂HPO₄·12H₂O。所用底物溶液为TMB母液(0.1g/100mL无水乙醇)10mL,底物溶液90mL,H₂O₂750uL临用前配制而成。所用封闭液为含1%BSA的PBST。所用酶标二抗是以PBST1:5000稀释。所用阳性血清对照标准品为使用鸭坦布苏病毒纯化EDIII蛋白经过四次免疫新西兰大白兔制备而成,作为标准阳性血清-20°C分装保存备用。所用阴阳性结果判定:当OD450检测值-阴性对照均值/阳性对照均值-阴性对照均值,所得比值大于等于0.2为阳性,小于等于0.2为阴性。本发明的有益效果:在筛选DTMUV抗原表位核心区域的基础上,建立了高敏感性、准确性和操控性强的间接ELISA检测方法,为有效预防和控制DTMUV的传播提供强有力的工具和技术支撑。
附图说明
图1.E蛋白3D结构示意图,其中DI为左端浅灰区域,DII为中段深灰区域,DIII为右端黑色区域;图2.鸭坦布苏病毒诱导表达图,其中:M:Markers,1:未诱导上清,2:未诱导沉淀,3:0.2mMIPTG18°C过夜(上清);4:0.2mMIPTG18°C过夜(沉淀);5:0.2mMIPTG25°C过夜(上清);6:0.2mMIPTG25°C过夜(沉淀);7:0.2mMIPTG30°C过夜(上清);8:0.2mMIPTG30°C过夜(沉淀)9:0.2mMIPTG37°C(上清)5h;10:0.2mMIPTG37°C5h(沉淀);图3.鸭坦布苏病毒EDIII蛋白纯度鉴定,其中:M:Markers,1,2均为EDIII蛋白纯化产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐明本发明有关内容。下列实例中未注明的具体试验方法,通常按照分子克隆实验室手册中所述的条件,或按照制造厂商提供的条件。实施例1抗原蛋白的获得鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域(以下简称EDIII)的表达,是在确定核心抗原域的基础上,首先设计鸭坦布苏病毒E蛋白DIII的PCR扩增表达引物EDIIIexp-1:5’-CATGCCATGGAAAGGCATGACCTACCCGATGTG-3’(包含NcoI酶切位点),EDIIIexp-2:5’-CCGCTCGAGACTTCTATGCCACTGGTACCT-3’(包含XhoI酶切位点),用于鸭坦布苏病毒EDIII的克隆。采用NcoI和XhoI双酶切PCR产物后,连入同样双酶切的pET32a中,构建重组表达质粒pET32a/EDIII,然后转化大肠杆菌表达菌株RosettagamiB(DE3)进行EDIII的高效活性表达。SDS-PAGE结果显示,当温度为18°C,IPTG浓度为0.2mM过夜诱导培养时,实现了EDIII蛋白的高效可溶性表达,蛋白表达量可占到菌体总蛋白的42%,并且蛋白具有天然活性。本发明所述的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域的表达还包括表达蛋白的高纯度制备。菌体进行超声破碎,收集上清蛋白,选用镍柱进行纯化。首先用含50mMTris和300mMNaCl(pH值8.0)的缓冲液平衡柱体,然后以合适的速度使上清蛋白经过柱体,最后用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱,洗脱液为50mMTris,300mMNaCl和0mM、20mM、40mM、50mM、250mM不同浓度的Imidazole(pH值8.0),收集洗脱的蛋白在20mMTris(pH7.4)的条件下透析。最终获得纯度为90%的高纯度蛋白。实施例2鸭坦布苏病毒EDIII间接ELISA方法抗原最佳包被浓度、最佳血清稀释度、抗原最佳包被条件、酶标二抗的工作浓度和时间通过以下方式获得:(1)抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定抗原与血清的浓度确定采用方阵滴定法。用20mMTris(pH7.4)对EDIII抗原蛋白进行倍比稀释,终浓度分别为1μg/ml,0.5μg/ml,0.25μg/ml,0.125μg/ml,每孔100μL横向包被酶标板,4°C过夜。然后使用PBST液洗三次,加入封闭液,37°C封闭2h。阴阳性血清从1:2000开始进行酶标板纵向的倍比稀释,稀释度分别为1:2000,1:4000,1:8000,1:16000,每孔加100uL,室温作用0.5h,PBST洗板3次。然后加入2000倍稀释羊抗鸭酶标二抗酶标二抗100uL,室温0.5h,PBST洗板3次,最后加入100uL1mg/mLTMB底物,室温作用15min后加入终止液,在酶标仪中测定OD450值。根据P/N值最终确定抗原的最佳包被浓度和阴阳性血清的最佳稀释度。当抗原浓度为0.5μg/ml,血清稀释度1:10000时,阳性血清的OD450值为1.0303(≈1),阴性为0.1597,P/N值最大为6.4493(见下表)。因此0.05μg抗原为包被最佳浓度,血清1:10000稀释是最佳稀释浓度。滴定方阵OD值ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="454"/>(2)抗原最佳包被条件的确定在最佳抗原包被浓度和血清稀释度确定的基础上,EDIII抗原的包被分别在室温(25°C)和37°C条件下作用20min、30min、45min、60min,然后4°C过夜,其他条件不变同(1)。当室温作用30min时阳性血清OD450值为1.0994,阴性血清OD450值为0.3156,P/N值最大,为3.4835。抗原最佳包被条件ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="310"/>(3)酶标二抗的工作浓度和时间的确定选用96孔ELISA板,每孔加入100uL0.5ug/ml的EDIII蛋白,用于包被ELISA板,包被液室温作用30min后4°C过夜,然后使用PBST液洗三次,加入封闭液,37°C封闭2h。加入1:10000稀释的阴阳性血清,每孔100uL,室温作用0.5h,PBST洗板3次。将HRP标记的兔抗鸭酶标二抗的工作浓度进行1:1000,1:2000,1:3000,1:4000,1:5000,1:6000稀释,室温分别放置为15min、30min、45min、60min,PBST洗板3次,最后加入100uL1mg/mLTMB底物,室温作用15min后加入终止液,在酶标仪中测定OD450值。酶标二抗进行1:5000稀释,室温作用30min,阳性与阴性OD450值相差最大,即P/N值最大。酶标二抗最佳作用条件ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="521"/>实施例3鸭坦布苏病毒EDIII间接ELISA的敏感性选用96孔ELISA板,每孔加入100uL0.5ug/ml的EDIII蛋白,用于包被ELISA板,包被液室温作用30min后4°C过夜,然后使用PBST液洗三次,加入封闭液,37°C封闭2h。加入1:2000-1:32000倍比稀释DTMUV阳性血清,每孔100uL,室温作用0.5h,PBST洗板3次后再加入100uL1:5000稀释的兔抗鸭酶标二抗,室温0.5h,PBST洗板3次,最后加入100uL1mg/mLTMB底物,室温作用15min后加入终止液,在酶标仪中测定OD450值,结果判定使用OD450检测值-阴性对照均值/阳性对照均值-阴性对照均值的计算方法,当所得比值大于等于0.2时为阳性,小于等于0.2时则为阴性。测定结果,当血清按照1:16000稀释时检测结果高于0.2为阳性,1:32000测定值小于0.2,为阴性,即体系的敏感性可达到1:16000。ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="267"/>到目前为止,亦有报道使用鸭坦布苏病毒E蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法(动物医学进展,2012,33(12):17-22),其确定的血清最佳稀释度为1:320,虽没有进行敏感性实验,但使用的稀释度低于本专利所使用的最佳稀释度两个数量级(10²倍),几乎没有有可比性,反映出本方案的检测灵敏度之高。实施例4鸭坦布苏病毒EDIII间接ELISA的特异性以鸭病毒性肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭新城疫病毒、禽流感病毒、禽白血病病毒、鸭瘟病毒阳性血清为对照,进行间接ELISA方法的特异性检测。选用96孔ELISA板,每孔加入100uL0.5ug/ml的EDIII蛋白,用于包被ELISA板,包被液室温作用30min后4°C过夜,然后使用PBST液洗三次,加入封闭液,37°C封闭2h。加入1:1000倍稀释的血清,每孔100uL,室温作用0.5h,PBST洗板3次后再加入100uL1:5000稀释的兔抗鸭酶标二抗,室温0.5h,PBST洗板3次,最后加入100uL1mg/mLTMB底物,室温作用15min后加入终止液,在酶标仪中测定OD450值。反应同时设阳性和阴性对照孔,结果判定使用OD450检测值-阴性对照均值/阳性对照均值-阴性对照均值的计算方法,当所得比值大于等于0.2时为阳性,小于等于0.2时则为阴性。结果DHV、ARV、NDV、AIV、ALV、DPV的阳性血清和阴性对照检测值均小于0.2,检测结果为阴性,鸭坦布苏病毒测定结果大于0.2,呈现阳性,表明该方法特异性良好。实施例5重复性试验分为批次内重复试验和批次间重复试验。进行批次内试验时,选用96孔ELISA板,用同一批次制备的抗原包被不同的ELISA板,每孔加入100uL0.5ug/ml的EDIII蛋白,包被液室温作用30min后4°C过夜,然后使用PBST液洗三次,加入封闭液,37°C封闭2h。加入1:1000倍稀释的50份待检血清,每份血清重复3次,每孔100uL,室温作用0.5h,PBST洗板3次后再加入100uL1:5000稀释的兔抗鸭酶标二抗,室温0.5h,PBST洗板3次,最后加入100uL1mg/mLTMB底物,室温作用15min后加入终止液,在酶标仪中测定OD450值。反应同时设阳性和阴性对照孔。批次内重复性试验中变异系数最大的为2.63%,而最小的仅为1.05%。批次间试验时,选用96孔ELISA板,用3批不同批次制备的抗原分别包被ELISA板,每孔加入100uL0.5ug/ml的EDIII蛋白,包被液室温作用30min后4°C过夜,然后使用PBST液洗三次,加入封闭液,37°C封闭2h。加入1:1000倍稀释的50份待检血清,每孔100uL,室温作用0.5h,PBST洗板3次后再加入100uL1:5000稀释的羊抗鸭酶标二抗,室温0.5h,PBST洗板3次,最后加入100uL1mg/mLTMB底物,室温作用15min后加入终止液,在酶标仪中测定OD450值。反应同时设阳性和阴性对照孔。同样根据OD值计算变异系数。同一份血清与不同批次制备抗原反应结果的变异系数均在3.7%以下,重复性良好。实施例6对比性试验对临床采集的78份开产前鸭(47周龄)血清分别用琼脂扩散试验(AGP)、抗体中和试验与建立的间接ELISA方法进行对比检测。间接ELISA方法检出阳性样品数量18个,阴性数量为60个,而AGP与中和抗体试验检出的阳性样品数量分别为2个和5个,均远低于间接ELISA方法的检测阳性率。间接ELISA检测方法与琼脂扩散方法、抗体中和方法检测对比试验检测方法阳性数量阴性数量间接ELISA1860AGP276抗体中和573上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受实施例的限制,其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式,都包含在本发明的保护范围之内。<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所<120>高效活性表达的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域蛋白的用途<160>3<210>1<211>309<212>DNA<213>鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus)<220><223><400>1aaaggaatgacctacccgatgtgtagcaatacattttccctagtgaagaatcctaccgac60actgggcatggcactgtcgtggtggaattgtcttatgcaggtaccgatgggccctgtaga120gttcccatatccatgtcggcagatctgaatgacatgacaccagttggacgcttgataaca180gtcaatccatacgtgtcgacctcctccacgggtgccaagataatggtggaagtggaacct240ccattcggggattcattcatcttagtaggaagtggaaaaggacagatcaggtaccagtgg300catagaagt309<210>2<211>33<212>DNA<213>人工合成<220><223><400>2CATGCCATGGAAAGGCATGACCTACCCGATGTG33<210>2<211>30<212>DNA<213>人工合成<220><223><400>3CCGCTCGAGACTTCTATGCCACTGGTACCT30